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B. Kollagen) in derselben Probe ist jedoch noch unklar.Um diese Lücke zu schließen, wurde zum ersten Mal die immunchemische Chemilumineszenz (CL)-Bildgebungsanalyse zur Kollagenlokalisierung angewendet.Anschließend wurden Laserablation – Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA–ICP–MS) und CL-Bildgebung kombiniert, um die Korrelation zwischen elementarer (dh REE, U, Sr, Ba) und Kollagenverteilung zu untersuchen.Es wurden Zähne und Knochen aus verschiedenen archäologischen Kontexten, chronologischen Perioden und mit unterschiedlichem Kollagengehalt analysiert.Die immunchemische Analyse zeigte eine heterogene Verteilung von Kollagen, insbesondere in stark abgebauten Proben.Anschließend zeigte LA-ICP-MS eine Korrelation zwischen dem Vorhandensein von Uran und Seltenerdelementen und Bereichen mit geringem Kollagengehalt.Die innovative Integration zwischen den beiden Methoden ermöglichte es, die gegenseitige Beziehung zwischen elementarer Variation und Kollagenerhaltung im Laufe der Zeit zu klären, und trug so dazu bei, die Auswirkungen diagenetischer Veränderungen in Knochen und Zähnen aufzudecken.Knochen und Zähne sind komplexe biomineralisierte Gewebe, die aus einer mineralischen Fraktion, hauptsächlich karbonatsubstituiertem Bioapatit, und einer organischen Fraktion, hauptsächlich Kollagentyp-I-Protein in Knochen und Dentin, bestehen1,2,3,4,5,6,7,8.Nach der Bestattung unterliegen Knochenstruktur und -zusammensetzung der Diagenese, d. h. der durch physikalischen, biologischen und chemischen Abbau induzierten Veränderung9,10,11,12,13.Ebenso kann Zahndentin einem biologischen und chemischen Abbau nach der Bestattung ausgesetzt sein9,14,15,16,17.Trotz der geringeren Resistenz von Knochen und Dentin gegenüber Diagenese als der stark mineralisierte Zahnschmelz liefert ihre Analyse chemische und isotopische Informationen über Ernährung und Herkunft.Darüber hinaus enthalten sie auch DNA und Proteine, aus denen Informationen zu Geschlecht, Taxonomie und Evolution für vergangene Rekonstruktionen menschlicher und tierischer Lebensgeschichten gewonnen werden können.Die Erhaltung der organischen Fraktion ist jedoch entscheidend, um solche Informationen durch archäometrische Untersuchungen zu erhalten.Während der Diagenese kann die mineralische Fraktion durch das Eindringen von Grundwasser in die Knochenstruktur beeinflusst werden, was eine Apatit-Rekristallisation, Änderungen in der Elementzusammensetzung und Adsorptionen an der Oberfläche von Bioapatit-Kristallen induziert18,19,20.Einige essentielle Spurenelemente, die während des Lebens reichlich vorhanden sind, nehmen nach der Bestattung ab, während andere, wie Seltenerdelemente (REE) und Uran (U), während der Diagenese eingebaut werden.Darüber hinaus kann die Hydrolyse den Bruch der Peptidbindungen induzieren, was zur Zersetzung von proteinartigen Materialien führt9,21,22,23,24,25,26.Diese Phänomene könnten zu einer heterogenen Erhaltung der organischen Fraktion innerhalb derselben Probe führen.Unter den untersuchten Elementen werden U und REE aufgrund ihrer bemerkenswert niedrigen Konzentrationen in frischen Knochen (< 1 µg/g) häufig als diagenetische Proxys zur Überwachung des Veränderungsgrades von Knochen (und Zähnen) verwendet.Ihre effektive Korrelation mit der Menge an konserviertem Kollagen wurde jedoch noch nicht ausreichend bewertet.Während der Diagenese wandern U und REE aus dem Boden in das Knochengewebe, hauptsächlich durch Grundwasser (dh Poren-Flüssigkeits-Wechselwirkung).Da Uran als Uranyl (UO22+) sehr wasserlöslich ist, wird es leicht in fossile Knochen eingebaut und stellt einen starken Marker für die chemische Veränderung des Knochenmineralanteils nach der Ablagerung dar27,30,31,32,33,34,35,36, 37,38.In ähnlicher Weise begann aufgrund der hohen Adsorptionskapazität von Knochenkristalliten für REE3+31 deren Adsorption sofort, wenn Knochen Porenwasser ausgesetzt wurden, was zu hohen REE-Gehalten in fossilen Proben führte (ΣREE bis zu mehreren 1000 µg/g)32.Strontium (Sr) und Barium (Ba) gelten als spezifische Biomarker für Trophieniveau und Ernährung33.Tatsächlich werden sie häufig bei der Ernährungsumstellung verwendet, daher sind ihre physiologischen Einschränkungen relativ gut bekannt und bieten eine solide Referenz für Studien zur Knochenchemie33.Aufgrund diagenetischer Prozesse, die die Substitution von Gitter-Ca2+ durch Alkalielemente nach der Bestattung fördern, sind Sr2+ und Ba2+ jedoch im Vergleich zu frischen Knochen in fossilen Knochen üblicherweise angereichert (~ 10 µg/g bzw. ~ 200 µg/g in menschlichen frischen Knochen). 24,27,34.Die Anreicherung der oben genannten Elemente kann theoretisch mit diagenetischen und abbauenden Wirkungen sowohl auf die anorganische als auch auf die organische Fraktion alter Knochen korreliert werden.Tatsächlich weisen Knochen und Zähne, die nur in begrenztem Maße von diagenetischem Abbau der mineralischen Komponente betroffen waren, in der Regel eine bessere Konservierung der organischen Fraktion auf26.Wird hingegen eine starke diagenetische Veränderung der Mineralstruktur beobachtet, weist auch die organische Komponente einen schlechteren Erhaltungszustand auf.Dies deutet auf einen möglichen gegenseitigen Schutz zwischen mineralischen und organischen Fraktionen hin, da der Abbau von Kollagen die mineralische Fraktion dem Eindringen von Wasser (aufgrund der erhöhten Porosität) aussetzt, was diagenetische Prozesse fördert, und gleichzeitig der Abbau der mineralischen Struktur das Eindringen von Wasser mit höherem erleichtert Risiko für Kollagenhydrolyse9,26,28,35.Entsprechend dieser Korrelation wurden bestimmte Elemente wie U und Sr, die üblicherweise als diagenetische Marker zur Beurteilung des Erhaltungszustands der mineralischen Bestandteile von Knochen und Zähnen verwendet werden, auch als Marker für die Bewertung des organischen Anteils verwendet Erhaltung in den gleichen Exemplaren26,27,29,30,36,37,38.Tatsächlich spiegelt die geringe Menge diagenetischer Elementarmarker eine begrenzte/keine Bioapatitveränderung wider und sollte daher einer Kollagenerhaltung entsprechen, da sowohl die Biomineral- als auch die Proteinphase eng miteinander verwachsen sind und sich gegenseitig schützen.Ein hoher Gehalt dieser Elemente weist dagegen auf eine stärkere Veränderung hin und postmortal sollte auch zu einem größeren Kollagenverlust führen.Bis heute ist die Beziehung zwischen der Variation von diagenetischen Markern und dem Vorhandensein von Kollagen in derselben Probe noch unklar und nicht ausreichend untersucht.Elementar- und Isotopenanalysen, basierend auf der Verwendung verschiedener Analysetechniken wie synchrotronbasierter Röntgenfluoreszenz39,40 und Laser-Ablations-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS)34,38,41,42,43 ,44,45, wurden angewendet, um gut erhaltene Bereiche (möglicherweise reich an Kollagen) zu identifizieren, die für Studien beprobt werden sollen, z. B. zur Datierung, Rekonstruktion der Paläodiät und taxonomischen Diskriminierung.Fourier Transform Infrared (FTIR) wurde auch angewendet, um den Abbauzustand von Knochen zu beurteilen.Insbesondere wurden das Amid-zu-Phosphat-Verhältnis und der Kristallinitätsindex verwendet, um die Konservierung der organischen Fraktion zu bewerten12,46,47,48,49,50.Hyperspektrale Nahinfrarot-Bildgebung (NIR-HSI) wurde kürzlich als Vorscreening-Methode für die Kollagenkartierung in archäologischen Knochen in Kombination mit einer normalisierten Differenzbilddatenverarbeitung (NDI) vorgeschlagen51.Dennoch wurden bis heute keine Untersuchungen durchgeführt, um die effektive Korrelation zwischen der Kollagenverteilung (mit hochselektiven Techniken unwiderlegbar identifiziert) und der elementaren Zusammensetzung der diagenetischen Marker in verschiedenen Bereichen derselben Proben zu bewerten.Erst kürzlich berichtete eine Studie über die parallele Untersuchung der REE-Verteilung und des Kollagens an einer einzigen Probe (einer gut erhaltenen Dinosaurier-Fibel).Kollagen wurde durch die Kombination von ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), angewendet auf Proteinextrakte, und in situ-Immunfluoreszenz, angewendet auf Knochenfragmente, nachgewiesen26.Die Ergebnisse deuteten auf eine Korrelation zwischen dem niedrigen REE-Gehalt und dem Vorhandensein von Kollagen hin.Die vorliegende Studie schlägt eine neue analytische Strategie zur Charakterisierung diagenetischer Signalwege in alten Knochen und Zähnen vor, die Element- und Kollagenverteilungsuntersuchungen kombiniert, die mit LA-ICP-MS bzw. immunchemischer Chemilumineszenz (CL)-Mikroskopie-Bildgebung erhalten wurden.Insbesondere wurde die immunchemische CL-Analyse zum ersten Mal auf archäologische und fossile Knochen und Zähne angewendet, um Kollagenprotein in komplexen biomineralisierten Matrizen empfindlich zu lokalisieren, was ein neues Werkzeug zum Screening auf das Vorhandensein von Proteinen seit der Charakterisierung von Proteinen in alten Skelettresten bietet kann Forschungsfragen zu Ernährung und genetischen Zusammenhängen ansprechen.Immunchemische Methoden nutzen die hohe Spezifität der Antigen-Antikörper-Erkennungsreaktion und gewährleisten den direkten und spezifischen Nachweis von Kollagen52,53,54,55.Diese Methoden sind in der Bioanalytik und klinischen Chemie weit verbreitet und haben sich in den letzten zehn Jahren als effiziente Methoden zur selektiven Identifizierung von Proteinen in Objekten des Kulturerbes erwiesen52,53,54,55,56,57,58,59,60 ,61.Der hier vorgeschlagene neue Ansatz bietet spezifische Vorteile, die es ermöglichen, mehrere Einschränkungen früherer Forschungsstudien zu überwinden: (1) eine größere Anzahl von Proben aus verschiedenen archäologischen Ausgrabungsstätten und gekennzeichnet durch unterschiedliche chronologische Perioden und Kollagengehalte wurden berücksichtigt;(2) die Verteilung von Kollagen wurde mithilfe des immunchemischen CL-Nachweises bestimmt, der sich als empfindlicher als die Immunfluoreszenz und als hochselektiv bei der spezifischen Identifizierung von Proteinen in komplexen Matrizen erwiesen hat61 und außerdem eine gute räumliche Auflösung und ein geringes Hintergrundsignal bietet;(3) Mehrere diagenetische Markerelemente wurden durch LA-ICP-MS-Analyse quantifiziert, wobei die kombinierte Verwendung von Einzelflecken und Laserablationsbildgebung ausgenutzt wurde62.Letzteres ermöglichte es, eine Verteilungskarte des interessierenden Elements zu erhalten, die direkt mit den CL-Kollagenbildern vergleichbar ist, was ferner die Identifizierung diagenetischer Markerelemente (dh REEs und U) ermöglichen könnte, die mit der Kollagenkonservierung korrelieren.Die Untersuchung von Proben aus verschiedenen Perioden/Altern und Ausgrabungsstätten ermöglichte die Bewertung des Einflusses verschiedener Variablen, die diagenetische Phänomene und damit die Kollagenerhaltung beeinflussen könnten, und identifizierte Elemente, die als repräsentative Marker für das Ausmaß der Diagenese verwendet werden können.Das Alter war die erste berücksichtigte Variable, um einen unabhängigen Marker zu identifizieren (dh vom frühen Mittelalter bis zum mittleren bis oberen Paläolithikum).Darüber hinaus wurden Proben aus demselben Zeitraum, aber von unterschiedlichen Standorten berücksichtigt, um die Auswirkungen der Diagenese auf Knochen aus verschiedenen ökogeografischen Regionen (dh Nord- und Süditalien) zu bewerten.Die Erforschung der Korrelation zwischen Kollagen und der Verteilung von diagenetischen Markern könnte nützlich sein, um die Phänomene besser zu verstehen, die die Aufnahme/Auswaschung von Elementen nach der Bestattung und den Abbau/Bewahrung von Biomolekülen fördern.Dies wiederum kann zukünftigen Arbeiten helfen, nicht veränderte biogene chemische Signale aus (fossilen) Knochen zu identifizieren und wiederzugewinnen.In dieser Studie wurden sieben archäologische Knochenfragmente und ein Zahn mittels CL-immunchemischer Mikroskopie-Bildgebung und LA-ICP-MS analysiert (Tabelle 1 und Abb. 1).Die Proben stammen aus verschiedenen Epochen und Orten.Proben aus dem mittleren bis oberen Paläolithikum stammten aus Höhlen, aber aus verschiedenen ökogeographischen Regionen Italiens mit einem anderen Klima (dh RB38 aus Norditalien, RSS1 und RSS2 aus Süditalien).Die Proben RSS1 und RSS2 wurden aus dem gleichen Knochen erhalten, aber sie wurden getrennt betrachtet, da die Diagenese heterogen unterschiedliche Bereiche des gleichen Knochens betreffen könnte.Ausgrabungsstätten der in dieser Studie betrachteten Skelettproben.Die vereinfachte geologische Karte wurde mit QGIS 3.18 (https://www.qgis.org/) von FL gezeichnet, basierend auf der geologischen Karte von 63.Ein spätpleistozäner Bisonknochen (FK BI RS 1), der in einer früheren Studie64,65 untersucht worden war, wurde dem vorgeschlagenen Analyseprotokoll unterzogen.Dieses Knochenfragment ist ein Querschnitt eines Bison sp.Tibia, die die gesamte kortikale Dicke freilegt (Abb. 2a).Die Probe wurde aufgrund ihrer besonderen Erhaltungsmerkmale mit einem äußeren Rand (2–3 mm) ausgewählt, an dem makroskopisch Kollagen offensichtlich stark abgebaut ist.Der innere Kortexanteil ist jedoch besser erhalten.Eine solche Zonierung ist auch aus zuvor am Knochen selbst durchgeführten mikrochemischen Analysen ersichtlich64.Insbesondere der Trend des abnehmenden C/N-Atomverhältnisses66 von 16,6 am äußeren Rand auf 3,2 zur Mitte der Knochenkompakta hin spiegelt die starke Einlagerung von Huminstoffen aus dem Boden im äußeren Knochenbereich wider, was auch durch die typische Dunkelbräunlichkeit hervorgehoben wird Färbung67.Die immunchemische Analyse zeigte tatsächlich das Vorhandensein des CL-Signals, das hauptsächlich innerhalb des inneren Teils der Knochenrinde lokalisiert war (Fig. 2b), mit einem geringeren Kollagengehalt im äußeren Teil der Probe.Stereomikroskopische (links) und KL-Aufnahmen (rechts) der untersuchten Probe FK BI RS 1 (1,25-fache Vergrößerung).Außenfläche ist links und Innenteil rechts.Bild 2a wurde von LG nach dem im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschriebenen Protokoll aufgenommen.Dies stimmt mit den erwarteten Konservierungsmustern überein, bei denen Kollagen im inneren Teil der Knochen wahrscheinlich besser konserviert wird, nämlich in den Bereichen, die weniger von Veränderungsprozessen aus der Umwelt und mikrobiellen Angriffen betroffen sind9,36,68.Anschließend wurden Line-Scan-LA-ICP-MS-Analysen an der Probe durchgeführt, um ihren Elementgehalt zu quantifizieren und das Vorhandensein potenzieller Elementgradienten im Zusammenhang mit den Unterschieden in der Verteilung organischer Substanz, die durch CL-Bildgebung beobachtet wurden, zu überwachen.Unsere Analyse zeigte einen gut erkennbaren Gradienten (Abb. 3a) von außen nach innen des Knochenfragments mit einer deutlichen Abnahme des Massenanteils von Ba und Sr in den innersten besser erhaltenen Bereichen (von 1000 µg/g bis hinunter zu 300 µg/g für Ba und von 600 µg/g bis hinunter zu 375 µg/g für Sr).REE (hier ausgedrückt als Summe des REE-Gehalts, dh ΣREE) und U wurden ebenfalls gemessen, um das Elementverhalten in gut erhaltenen und veränderten Bereichen besser zu untersuchen (Abb. 3b).Trotz der großen Varianz der Massenanteilswerte entlang der Probe nehmen ΣREE und U deutlich um mehrere Größenordnungen zum inneren Teil des Knochens hin ab (von 200 µg/g auf 0,01 µg/g für U und von 5 µg/g auf bis zu 0,01 µg/g). 0,01 µg/g für ΣREE).Der innerste Teil der Compacta von FK BI RS 1 nahe der Markhöhle weist eine leichte Anreicherung an ΣREE und U auf.10.000 µm (weniger als 0,1 µg/g) bis zum rechten Rand der Probe (bis 20 µg/g).Zu beachten ist, dass diese Anreicherung bezogen auf den absoluten Massenanteil ca. 10 mal geringer ist, verglichen mit der äußersten Knochenoberfläche (Abb. 3).Daher kam es zu einer anderen, wenn auch weniger ausgeprägten, diagenetischen Elementaufnahme aus der Markhöhle – die nach der Zersetzung leer blieb und üblicherweise nach der Ablagerung durch lokalen Boden gefüllt wurde.Elementarprofile (Sr, Ba, U und ΣREE) werden mit dem CL-Kollagensignal von FK BI RS 1-Knochen verglichen.Außenfläche ist links und Innenteil rechts.Spikes in Sr- und Ba-Profilen bei ca.5600 µm und 9000 µm spiegeln möglicherweise das Vorhandensein von sekundären Knochenporositätsfüllungen nach der Ablagerung durch diagenetische Mineralien oder Sedimente wider.Beachten Sie, dass U und ΣREE im logarithmischen Maßstab angegeben sind.Halbquantitative Intensitäten des Lichtsignals wurden aus dem CL-Bild selbst entlang des LA-Profils unter Verwendung von Icy 2.1.2.0 (icy.bioimageanalysis.org69) interpoliert und als relative Intensitäten (auf den Maximalwert skaliert) angegeben.Um ein repräsentatives gemitteltes Signal des interessierenden Bereichs zu erhalten, wurden Daten von sechs äquidistanten Linien gesammelt.Schließlich wurde ein LOWESS-Glättungsfilter (Span 0,1) auf das resultierende gemittelte Signal angewendet.Mehrere andere Knochen (Tabelle 1) wurden mit dem integrierten CL- und LA-ICP-MS-Ansatz analysiert, um die mögliche Korrelation zwischen Kollagenverlust und Elementaufnahme nach der Beerdigung besser aufzuklären.Die Anwendung des CL-Immunoassays auf die ausgewählten Proben ermöglicht es, gut nachweisbare CL-Signale für fast alle Proben zu erhalten, wenn auch mit unterschiedlicher räumlicher Verteilung (Abb. 4).Probe S37 (Abb. 4a, d) zeigte ein intensives CL-Signal, das sich über die gesamte Probenoberfläche ausbreitete, wie es für eine relativ moderne Knochenprobe (Mittelalter) zu erwarten war.Andererseits zeigt Probe S40, die aus demselben archäologischen Kontext wie S37 stammt, eine heterogenere Kollagenerhaltung und -verteilung (Abb. 4b,e).Probe S2 (Abb. 4c,f) gehört zum mittleren bis oberen Paläolithikum (> 50 ka) und zeigt zwei unterschiedliche Bereiche mit unterschiedlichem Kollagengehalt.Insbesondere der kollagenarme Bereich scheint makroskopisch durch die Ausfällung von sekundären Calciumcarbonatmineralien gekennzeichnet zu sein, wie die gelbliche Färbung vermuten lässt.Lichtmikroskopische (oben) und CL-Aufnahmen (unten) von untersuchten archäologischen Faunenknochenproben mit bekanntem Alter und bekannter Herkunft (Tabelle 1): (a,d) Probe S37 (5-fache Vergrößerung, äußere Oberfläche ist oben und der innere Teil ist unten), (b,e) Probe S40 (1,25-fache Vergrößerung, Außenfläche oben und Innenteil unten), (c,f) Probe S2 (1,25-fache Vergrößerung, Innenfläche oben und Außenfläche). Teil ist unten), (g,j) Probe RSS1 (1,25-fache Vergrößerung, innere Oberfläche ist oben und äußerer Teil ist unten), (h,k) Probe RSS2 (1,25-fache Vergrößerung, innere Oberfläche ist oben und der äußere Teil ist unten), (i, l) Probe RB38 (1,25-fache Vergrößerung, innere Oberfläche ist oben und der äußere Teil ist unten).LA-ICP-MS-Analysepunkte werden in CL-Bildern gezeigt, die in Bereichen mit „hohem“ (orange) und „niedrigem“ (grün) Kollagengehalt platziert sind.Die Knochenfragmente RSS1 (Abb. 4g, j) und RSS2 (Abb. 4h, k), die aus verschiedenen Bereichen derselben Knochenprobe entnommen wurden, zeigten beide stärkere CL-Signale im zentralen Bereich des Fragments.Probe RB38 (Abb. 4i, l) zeigte kein signifikantes CL-Signal, daher lag die Kollagenmenge unter der Nachweisgrenze54.CL-immunchemische Untersuchungen wurden in mikrochemische LA-ICP-MS-Analysen integriert.Ablationspunkte wurden basierend auf Bereichen mit unterschiedlichem Kollagengehalt basierend auf CL-Bildern ausgewählt, mit dem Ziel, mindestens drei LA-Punkte pro Bereich (niedriger vs. hoher Kollagengehalt) zu erhalten.Dadurch konnten spezifische Informationen für die Bereiche mit differenziertem Kollagengehalt gesammelt werden.Für jede Knochenprobe wurden gemäß den CL-Ergebnissen Bereiche identifiziert, die durch „hohen“ und „niedrigen“ Kollagengehalt gekennzeichnet waren.Die Identifizierung von Bereichen mit hohem oder niedrigem Kollagengehalt hängt mit dem Vorhandensein oder Fehlen des CL-Signals im untersuchten Bereich zusammen.Wenn das CL-Signal nicht erkannt wird (dh es liegt unter der Nachweisgrenze von 0,3 ng/Spot54), wird der Bereich als kollagenarm eingestuft.Ist das CL-Signal dagegen gut nachweisbar, wird der Bereich als hoch kollagenhaltig eingestuft.Die Identifizierung der zwei unterschiedlichen Bereichstypologien auf der Grundlage des CL-Signals erlaubte es, die Auswahl der Bereiche für die Elementaranalyse zu leiten, wobei mögliche Unterschiede in den diagenetischen Wegen zwischen den Proben identifiziert wurden (Abb. 5).LA-ICP-MS-Spotanalysen (ΣREE, U, Sr, Ba) auf „high-“ (orange Kreise) und „low-“ (grüne Rauten) Kollagenbereiche von Knochenproben.Diese Bereiche wurden basierend auf CL-Bildern visuell ausgewählt.Ein Biplot von Ba vs. Sr-Gehalt wird berichtet, um Unterschiede zwischen den Proben hervorzuheben, die möglicherweise in vivo aufgrund von Eingaben wie Ernährung, Physiologie oder lokaler Geologie entstanden sind.Ein Biplot von U vs. ΣREE-Gehalt wird ebenfalls berichtet, um die t-Test-Ergebnisse hervorzuheben und die Unterschiede zu zeigen, die mit Bereichen mit hohem und niedrigem Kollagengehalt in den Knochenproben korrelieren.Fehlerbalken (2 SE) sind kleiner als die Symbolgröße.Zwei-Standard-Fehler werden basierend auf wiederholten Messungen (n = 9) von NIST SRM 1400 Knochenasche (Sr: 4 µg/g; Ba: 19 µg/g; U: 0,1 µg/g; ΣREE: 0,35 µg/g) berechnet. .Die für diese Proben erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Ein zweiseitiger t-Test legt nahe, dass die Sr-, ΣREE- und U-Gehalte im Durchschnitt in Bereichen mit niedrigem Kollagengehalt signifikant höher sind (siehe z. B. Fig. 5).Der für Sr-Daten durchgeführte t-Test wird wahrscheinlich durch Probe RB38 beeinflusst, die eine Anreicherung des Sr-Gehalts zeigt (ca. 550 µg/g; siehe „Diskussion“; p nach Entfernung von RB38 ist 0,342).Offensichtlich in Bezug auf die organische Konservierung beeinträchtigt, fehlt für RB38 ein Vergleich mit einem gut erhaltenen Kollagenbereich.Nach dem Entfernen von RB38 aus dem Datensatz können keine signifikanten Unterschiede im Sr-Gehalt zwischen Bereichen mit niedrigem und hohem Kollagengehalt beobachtet werden (zweiseitiger t-Test; p = 0,342; Abb. 5).In Bezug auf den Ba-Gehalt sind Bereiche mit niedrigem und hohem Kollagengehalt statistisch nicht unterscheidbar (zweiseitiger t-Test; p = 0,932).Um die Korrelation zwischen Element- und Kollagenverteilungen in diesen Knochen weiter zu untersuchen, wurde Probe S2 zusätzlich einer LA-ICP-MS-Bildgebung unterzogen (Abb. 6).Es ist erwähnenswert, dass die zur Berechnung des absoluten Massenanteils in LA-Spots verwendete Normalisierungsmethode, dh die Verwendung von 44Ca als interne Referenz, potenzielle Unterschiede in den elementaren Massenanteilen für diejenigen Proben geglättet haben könnte, die Rekristallisationsereignissen unterzogen wurden.Der Ca-Gehalt wurde tatsächlich als konstant und gleich dem von modernem Knochen-Bioapatit (ω ~ 26,5 %) angenommen.Elementarbilder von Probe S2, erhalten durch LA-ICPMS.(a) Mikrofotografien der Probe, (b) CL-Bild der Kollagenverteilung, (c) 238U, (d) 137Ba, (e) 88Sr, (f) 175Lu (als Proxy für den REE-Gehalt).Beachten Sie, dass die Elementarbilder nicht auf einen internen Standard normalisiert, sondern als rohe cps (Zählungen pro Sekunde) gemeldet werden.Karten wurden unter Verwendung eines MATLAB 2010a-Skripts62 erhalten.Die integrierte Methode wurde auch auf einen Zahn einer süditalienischen Fundstelle aus der Römerzeit (Velia_T44070, Abb. 7a) angewendet, um die Korrelation zwischen Kollagen- und Elementverteilung in verschiedenen Arten von Skelettresten zu bewerten.Entsprechend der Zahnzusammensetzung war Kollagen eindeutig im Dentin lokalisiert, was durch ein intensives CL-Signal gezeigt wurde, während erwartungsgemäß kein Signal im hochmineralisierten und kollagenfreien Schmelz detektiert werden konnte (Abb. 7b).Bild des Zahns Velia_T440 (1,25-fache Vergrößerung).(a) Optisches Mikroskop, (b) CL-Bild mit Punkten der LA-ICP-MS-Spotanalyse.Helle Linien sind auf Risse zurückzuführen, (c) LA-ICP-MS-Punktanalysen (ΣREE, U, Sr, Ba).Fehlerbalken (2 SE) sind kleiner als die Symbolgröße.Zwei-Standard-Fehler werden basierend auf wiederholten Messungen (n = 9) von NIST SRM 1400 Knochenasche (Sr: 4 µg/g; Ba: 19 µg/g; U: 0,1 µg/g; ΣREE: 0,35 µg/g) berechnet. .Auf dem Dentingewebe (Abb. 7c) wurde eine LA-ICP-MS-Punktanalyse gemäß den Intensitäten des CL-Signals durchgeführt, um die bereits für die Knochen beobachteten diagenetischen Marker zu überwachen.Insbesondere Daten, die von den Punkten D und E gesammelt wurden, in einem Bereich, der durch das Fehlen eines CL-Signals und somit mit einem wahrscheinlich schlechten Kollagengehalt gekennzeichnet ist, weisen wie erwartet die höchsten Sr-, Ba- und ΣREE-Gehalte auf.Im Gegensatz dazu wurden an allen anderen Stellen niedrigere Sr-, Ba- und ΣREE-Gehalte nachgewiesen, die durch ein relativ hohes CL-Signal gekennzeichnet sind.Die Ergebnisse dieser Studie weisen deutlich auf unterschiedliche Konservierungszustände innerhalb und zwischen den Proben hin, was zu einer variablen Kollagen- und Elementzusammensetzung sogar innerhalb derselben Probe führt.Dies kann auf die Heterogenität der Abbauerscheinungen nach der Bestattung zurückgeführt werden.Aufgrund der Spezifität und Selektivität der immunchemischen CL-Bildgebungsanalyse war es möglich, Kollagen54 innerhalb von Skelettproben unterschiedlicher Zusammensetzung und Konservierung eindeutig zu lokalisieren.Es ist erwähnenswert, dass die Anti-Kollagen-Typ-I-Antikörper eine hohe Interspezies-Kreuzreaktivität aufweisen54, was die Identifizierung von Kollagen in allen Proben, die zu verschiedenen Spezies gehören, sicherstellt.Darüber hinaus zeigte die Anwendung des integrierten Protokolls eine starke Korrelation zwischen dem organischen Gehalt und dem Gehalt an diagenetischen Markerelementen (dh REEs und U) in Knochen und Dentin.Uran und REE wurden bereits als diagenetische Marker für die Knochenversteinerung identifiziert, die die umgebende Umgebung nach der Bestattung widerspiegeln38.Sowohl U als auch REE fehlen normalerweise oder kommen nur in einem sehr geringen Massenanteil (< 1 µg/g) in frischem Knochen vor, aber nach der Vergrabung können sie aus Grundwasser und Boden aufgenommen werden, wodurch ihre Massenanteile in bestimmten Bereichen des vergrabenen Knochens erhöht werden25 ,28,37.Strontium und Barium hingegen sind Biomarker für die Ernährungsumstellung, die in vivo in Knochen zwischen zehn und hundert µg/g vorhanden sind (noch weniger für Ba).Ihre endogene Signatur kann jedoch durch exogene Prozesse nach der Ablagerung überlagert werden16,24.Diese Arbeit zeigte zum ersten Mal, dass diagenetische Elementarmarker für Bioapatit aufgrund ihrer beobachteten Korrelation mit CL-Kollagensignalen für Kollagenkonservierungsstudien angewendet werden könnten.In unseren Daten zeigte FK BI RS 1 hohe Sr- und Ba-Werte im äußeren Rand, gekoppelt mit U- und REE-Anreicherung, aufgrund des Einbaus von Elementen aus der Umgebung in die Bioapatitstruktur, möglicherweise verbunden mit einem einfachen Diffusionsaufnahmemodell, wie zuvor auch von Ullman und Kollegen erklärt24,26.Andere Knochenproben zeigten jedoch bemerkenswert variable Sr- und Ba-Gehalte und eine fehlende Korrelation mit dem Grad der Kollagenerhaltung, was einen möglichen anderen diagenetischen Weg hervorhebt.Tatsächlich könnten Unterschiede in der Bestattungsumgebung und/oder postmortalen Elementaufnahmeprozessen die unterschiedliche diagenetische Veränderung von Sr und Ba im Vergleich zu REE und U71 beeinflussen.Wie erwartet wurde in den LA-ICP-MS-Daten eine relativ hohe Variabilität (siehe die Variationskoeffizienten in Tabelle 2, berechnet als Std.-Abweichung dividiert durch den Mittelwert) beobachtet, da die Proben aus unterschiedlichen taphonomischen und zeitlichen Kontexten stammen.Darüber hinaus zeigen wie erwartet diagenetische Marker (dh REEs und U) eine höhere Variabilität als Sr und Ba.Die LA-ICP-MS-Mapping-Ergebnisse auf S2 betonten, was durch Spot-Analysen beobachtet wurde.Interessanterweise war U bevorzugt in Bereichen ohne Kollagenkonservierung verteilt, was die makroskopisch sichtbare venenartige diagenetische Füllung nachahmt, was die negative Korrelation zwischen diagenetischen Markern von Kollagen und Spurenelementen weiter bestätigt.In ähnlicher Weise scheint Ba stärker in den diagenetisch veränderten Teilen konzentriert zu sein.Der REEs-Gehalt (hier Lutetiumverteilung) in S2 ist zu gering, um sinnvoll interpretiert zu werden.Strontium scheint homogener in der Probe verteilt zu sein, mit einigen höheren Gehalten in den sekundären Venen.Darüber hinaus war in den CL-Ergebnissen die Variabilität des Kollagengehalts zwischen Proben von Orten ähnlichen Alters (RB38, RSS1, RSS2) und auch innerhalb derselben Probe (RSS1, RSS2) offensichtlich, was darauf hindeutet, dass die Umweltbedingungen und die Geschichte nach der Bestattung von die Knochenproben können zu sehr unterschiedlichen Erhaltungszuständen führen.Beispielsweise stimmt das Fehlen eines Signals in RB38 mit der angezeigten weißlichen Färbung überein, was möglicherweise auf eine Exposition gegenüber hohen Temperaturen hinweist72, die den Abbau von organischem Material verursachten.Auch die unterschiedlichen taphonomischen Kontexte müssen berücksichtigt werden.Tatsächlich können die lokalen Umweltbedingungen (dh pH-Wert, Temperatur, Feuchtigkeit, Bodenzusammensetzung) und die Taxonomie (dh Knochenstruktur) zu unterschiedlichen diagenetischen Wegen und Verläufen führen16,24,28,35.Gleichzeitig erschwert die Variabilität der zahlreichen In-vivo-Faktoren (dh Ernährung, Mobilität, Physiologie) die Entkopplung der unveränderten Knochenelementsignale und der diagenetischen Überprägungen.Im Allgemeinen weisen unsere Daten auf eine negative Korrelation zwischen der Erhaltung von Kollagen (und allgemeiner der organischen Fraktion) und der Elementaufnahme während der Diagenese hin.Ein ähnliches Ergebnis wurde in früheren Untersuchungen26 erzielt, in denen eine mögliche Korrelation zwischen REE und Kollagen festgestellt wurde.Diese Hypothese basiert jedoch nicht auf der direkten und räumlich aufgelösten Korrelation zwischen elementaren und immunchemischen Daten für einen bestimmten Knochenbereich.Im Gegenteil, der hier vorgestellte analytische Ansatz beinhaltete zunächst eine sensitive räumliche Lokalisierung von Kollagen in verschiedenen Bereichen derselben Probe, auf deren Grundlage die Untersuchung chemischer diagenetischer Marker durchgeführt wurde, um so effektive Informationen über die Korrelation von Daten mit einem hohen räumlichen Wert zu erhalten Auflösung.Wie hervorgehoben, müssen spezifische diagenetische Vorgeschichten von Fall zu Fall ausgewertet werden.Zum Beispiel zeigt der niedrige REE-Gehalt der Probe RB38, verbunden mit einem fast Null-CL-Signal über die gesamte Probe hinweg, dass das lokale diagenetische Endmitglied durch eine erschöpfte REE-Signatur gekennzeichnet ist.Dennoch deuten die erhöhten U- und Sr-Gehalte immer noch darauf hin, dass diese Proben nach der Ablagerung starken Modifikationen unterzogen wurden.Aufgrund des wachsenden Interesses an Zähnen als biologische Informationsarchive wurde die kombinierte organische und anorganische Konservierung einer Zahnprobe (Velia_T440) untersucht, um die Widerstandsfähigkeit des Dentins gegenüber diagenetischen Veränderungen besser abzuklären.Wie Knochen enthält Dentin große Mengen an proteinhaltigen Materialien (ca. ω = 20 %) und neigt zu Veränderungen nach der Bestattung, während Zahnschmelz ein hartes Gewebe ist, das aus einem kleinen organischen Anteil (ω < 5 %) besteht, dessen Hauptbestandteile sind Amelogenine73.Das CL-Signal erscheint ziemlich homogen, abgesehen von kleinen Bereichen, die makroskopisch durch eine dunkle Färbung gekennzeichnet sind.Wie erwartet ist im Zahnschmelz keine CL-Reaktion sichtbar.Die Ergebnisse bestätigen die negative Korrelation zwischen dem CL-Kollagensignal und der relativen Anreicherung von Tracern für diagenetische Veränderungen wie REEs.Ein ortsspezifisches diagenetisches Endglied könnte jedoch die Erhaltung von in-vivo-Elementarsignalen beeinflussen, wie im Fall von Velia_T440.Es ist erwähnenswert, dass U einen unerwarteten Trend bei Velia_T440 im Vergleich zu Knochen zeigte.Tatsächlich wird der höchste U-Gehalt in Punkt B angezeigt, der in einem kollagenreichen Bereich mit niedrigen ΣREE-, Sr- und Ba-Gehalten lokalisiert ist.Für diesen Zahn scheint ΣREE den Kollagenabbau besser vorherzusagen als U. Insbesondere wurde trotz des relativ jungen Alters der Probe ein bemerkenswert hoher U-Gehalt (bis zu ca. 35 µg/g) im Dentin beobachtet.Dies könnte darauf hindeuten, dass das lokale Grundwasser reich an U war, möglicherweise aufgrund geologisch verwandter (dh vulkanischer) Quellen im kampanischen Gebiet74.Trotz der scheinbar schlechten elementaren Konservierung von Velia_T440 ist Kollagen immer noch vorhanden und recht homogen verteilt.Solche Beweise könnten darauf hindeuten, dass in diesem Fall der diagenetische Weg durch Oberflächenadsorption und/oder Komplexierungen von Ionen mit organischen Molekülen (wie Huminsäuren) mit geringer Kollagenhydrolyse und begrenzter Wiederausfällung sekundärer Mineralphasen gekennzeichnet war75.EUR.Artikel CAS PubMed Google Scholargem.Chem.AuflösungMed.Int.AuflösungChem.Chem.Anal.Chem.Chem.Anal.Chem.Int.Anal.Chem.Anal.Chem.Int.Anal.Anal.Chem.Int.Appl.EUR.Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.